匿名使用者 2017-04-21

小鼠mdsc和中性粒細胞怎麼區分

中性粒細胞（PMN）是機體防禦系統的主要組成部分，能吞噬和殺滅多種致病原。致病原與血清中的特異性抗體（IgG）結合後，透過IgG的Fc部分與PMN表面的受體——FcγRⅢ（CD16b）相結合，從而被吞噬。FcγRⅢ有a、b兩種型別，FcγRⅢa（CD16a）是一種跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb（CD16b）是一種糖肌醇磷脂蛋白（GPI-錨蛋白）［1］。近年發現陣發性睡眠性血紅蛋白尿症（PNH）患者在血細胞表面缺失各種特異的GPI-錨蛋白，CD16b正是這類蛋白之一。為探討PMN表面CD16b的缺失與PMN釋放氧自由基殺菌功能的關係，將我們的研究報告如下。

材料和方法

1標本採集正常人外周血取自協和醫院血庫正常獻血者，正常骨髓取自協和醫院胸外科手術患者的肋骨，PNH患者按1987年全國溶血性貧血會議擬定的診斷標準，並經流式細胞儀免疫熒光法檢測CD59標記率進一步確診。

2中性粒細胞的分離 新鮮的外周血或骨髓，用肝素抗凝，經淋巴細胞分離液分離，去除淋巴細胞和單個核細胞，用右旋糖酐（dextran，分子量=7～11 萬） 沉降和低滲法去除紅細胞，得到純淨的中性粒細胞。用臺盼藍染色法檢查細胞活力，須保證細胞存活率大於95%。

3間接免疫熒光法檢測CD16取1×106個細胞，懸浮於100μl 2% BSA中，室溫封閉30分鐘，加 CD16單克隆抗體（Immunotech SA公司產品），在室溫作用30分鐘後，用PBS洗滌2次，再懸浮於100μl 2％BSA中，加FITC 標記的羊抗鼠IgG（Gibco公司產品）室溫暗染20分鐘後洗去二抗。用500μl PBS懸浮細胞，用流式細胞儀檢測CD16 標記率。

4中性粒細胞功能測定 佛波醇酯（PMA，Sigma產品，用DMSO溶解，配製成1mg/ml，儲存於－20℃，臨用前稀釋）能啟用中性粒細胞，使之釋放活性氧，其中O-2*和H2O2能與化學發光劑Luminol（3-氨基苯二甲醯肼，北京化工廠）反應而發光。用LKB-1250發光儀（Luminometer）檢測。正常人和PNH患者中性粒細胞，製備成細胞懸液（107 /ml）與 100nmol/L PMA 反應，37℃15分鐘，置於冰上終止反應，取含1×105 細胞的啟用液加入到1ml 0。1nmol/L 的Luminol 溶液中，立即測定發光值，每一數值測定3次以上， 取平均值。取正常人的不同細胞數，測定發光值，結果顯示發光值與細胞數有良好的線性關係，說明此方法具有可靠性 （附圖）。

附圖細胞數與發光值的線性關係

5細胞培養以 1×106個細胞/ml的密度接種PMN於IMDM培養基（含10%自身血清），37℃、5% CO2分別培養12，16，20小時。

6細胞形態學觀察不同培養時間的細胞用瑞氏染色，光學顯微鏡下觀察。

7DNA含量分析取細胞1×106，PBS洗2遍，以70%冷乙醇（4℃）固定12小時以上，用PBS洗去乙醇，加入0。5ml檸檬酸-磷酸緩衝液（pH 7。8）室溫作用5分鐘，離心後以PBS重懸細胞，加入 RNaseA （終濃度60μg/ml）37℃作用30分鐘，再加入碘化乙錠（PI，終濃度50μg/ml）4℃暗染30分鐘，以染細胞內總DNA，用流式細胞儀分析正常細胞和凋亡細胞，計算凋亡率。