風雨過後GO 2021-04-08

1。1細胞

①將細胞培養皿置於冰上，用冰冷得PBS洗滌細胞2次

②吸出PBS，加入裂解液（碧雲天P0013；1%TritonX-100；）

a。融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。

b。對於貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗）。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細胞1-2秒後，細胞就會被裂解。（一般10*7個細胞用100ul裂解後獲得的上清蛋白濃度約為2-4mg/ml）

③用刮刀刮下貼壁細胞，轉移至EP管，14000rpm離心5分鐘

④將上清液轉移至EP管，負20℃儲存

1。2組織

①將組織樣品剪成細小碎片（最好在冰上進行）

②加入裂解液

a。融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據實驗需要加入適當的上述蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物。

c。按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當新增更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。）

d。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。如果組織樣品本身細小，可適當剪下後直接加入裂解液，透過強烈渦旋使樣品裂解充分

（每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解後獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態的不同組織有所不同）

③充分裂解後，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清

2。 蛋白定量（Thermo UF289356）

2。1稀釋白蛋白（BSA）標準液的製備

2。2 製備BCA工作液（A液：B液=50：1 密閉室溫可以儲存一段時間）

總體積=（#標準孔+#未知孔）*#復孔*每個樣本的體積

測試管每管2ml；96孔板每孔200ul。

2。3 濃度測定

①將25ul標準液和樣本設定復孔加入96孔板，按照樣本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液（如果樣本有限就加10ul比例用1：20；推薦每個待測的樣本做2-3個平行反應；根據樣品的濃度，可提前稀釋5-10倍）

②最好搖勻30秒，將96孔板在37℃孵育30min

③冷卻至室溫，酶標儀設定為562nm，在5分鐘內測試完所有的樣本。

④所有的樣本減去空白對照在562nm處的吸光度，繪製標準曲線，確定樣本的濃度

3。 蛋白電泳

3。1 變性以及還原蛋白

在蛋白樣品中加入含SDS（保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致）的上樣緩衝液，100℃加熱煮沸。

3。1。1室溫溶解蛋白上樣緩衝液（5×），按照4 uL蛋白樣品+1 ul （5×）的比例混合。

3。1。2 100℃或沸水浴加熱10分鐘，以充分變性蛋白

3。1。3 冰上驟冷，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可

3。1。4通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近則可以停止電泳

4。 SDS-PAGE凝膠電泳

4。1 膠的選擇與製備（根據目的蛋白的大小，選擇合適的分離膠的濃度）

4。2 配膠（碧雲天P0012AC）

洗乾淨玻璃板，裝板加水驗漏後，晾乾裝到制膠架上。根據配方配膠。

（配膠順序：先配分離膠（下層膠），充分凝固後，再配濃縮膠（上層膠））

4。2。2 配製濃縮膠（上層膠）

4。2。3 組裝制膠器

①將製備好的分離膠灌入制膠板內（緩慢不要有氣泡），隨後緩慢加入適量異丙醇壓平分離膠。

②20-30分鐘分離膠凝聚完成，傾斜板，倒掉異丙醇，吸水紙吸去殘餘液體，棄去上層壓膠的水或醇。

③加入配好的濃縮膠灌入制膠板內，然後插上梳子，20-30分鐘濃縮膠即可凝聚。

④緩慢取出梳子，上樣。

4。2。4 上樣及電泳

①蛋白冰上溶解，調整蛋白濃度，和等體積5×上樣緩衝液混合，即為上樣液。用純水沖洗膠板，放入電泳槽

②兩塊板之間倒入電泳液，確認無漏液

③迅速拔出梳子，用槍輕輕吹孔使碎片衝出

④依次加入蛋白marker和蛋白樣品，每孔加上樣液20ug，留一孔加預染的marker。加滿電泳緩衝液，蓋上槽蓋，接通電源，先用70V恆壓電泳，約30min，當指示劑溴酚藍進入分離膠後改用90V恆壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約0。5cm處時關閉電源，取出膠板。（上樣時間儘量短，避免樣品擴散，但也不能過快避免樣品溢位而造成相鄰加樣孔的交叉汙染，未加樣的孔中加入等量的樣品緩衝液）

⑤調節電泳的電壓和時間，傳統膠是上層膠80V，30min；下層膠120V 90-120min。

（為了防止蛋白條帶再凝膠上擴散，電泳後應儘快轉膜）

5。 轉膜

將蛋白凝膠中的蛋白，透過電流作用轉移到轉印膜上。由於蛋白凝膠本身易碎，蛋白條帶容易子啊凝膠中擴散，而且抗體也不易於進入凝膠中與目的蛋白結合，所以需要在轉印膜這樣的固相載體上實現後續封閉、洗滌，顯色等實驗操作。

5。1 轉膜

①將減好的PVDF膜用無水甲醇潤溼30秒以上，然後用dd H2O漂洗2min，浸泡於轉移緩衝液中5min後開始後續操作

②裝配轉膜三明治結構（在轉移緩衝液中製備三明治可以避免氣泡的產生）

黑麵（負極）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面（正極），每層之間不能有氣泡。然後將三明治轉移至電泳槽中，黑麵對黑麵。

西安格物 2020-11-24

蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot，簡稱WB。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。

匿名使用者 2018-11-20

RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光檢測液、預染蛋白Marker、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）-HRP、脫脂奶粉、PBS緩衝液、SDS上樣緩衝液、電泳緩衝液、轉膜緩衝液、TBST緩衝液、PVDF膜。。。等等太多了。

一個Western blot試劑盒足以了，Elabscience WB試劑盒一個全搞定，你可以瞭解下。

yiyi1314919 推薦於2017-11-25

試劑：tris、Hcl、Nacl、脫脂牛奶、甲醇、甘氨酸、tuwen20、一抗、二抗、顯色劑及SDS-PAGE需要的試劑（tris、Hcl、TEMED、SDS、過硫酸銨、丙烯醯胺、N，N-甲叉雙丙烯醯胺、甘氨酸、非預染蛋白Marker、甲醇、乙酸、考馬斯亮藍R250）、預染蛋白Marker

耗材：濾紙、PVDF膜或NC膜、乳膠手套等

儀器：電泳儀、電轉槽、搖床、製冰機（電轉時需冰浴）等

這_五年 2012-04-12

這就多了