linaismf2017-05-15

我認為，“溴酚藍帶（約300bp）前後各有一條帶，且兩條帶亮度差不多”，而“陰性對照（沒加模板）只在溴酚藍帶後有一條帶”。可以用實驗組和陰性對照組比較，若兩者溴酚藍帶後的帶位置一直，那麼應該是引物二聚體。

至於PCR，應從很多方面考慮，我有一個最佳化的方法：

PCR必需具備下述基本條件：模板核酸（DNA或RNA）、人工合成的寡核苷酸引物、合適的緩衝體系、合適的Mg2+濃度、三磷酸脫氧核苷酸、耐熱DNA聚合酶、溫度迴圈引數、其它因素如二甲基亞碸、甘油、石蠟油、明膠等。

1．引物

PCR擴增產物的大小是由特異引物限定的，因此引物的設計與合成對PCR的成功與否有著決定性的意義。

l引物合成的質量：合成的引物必須經聚丙烯醯胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引物中會有相當數量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌吟產物以及可檢測到的鹼基修飾的完整鏈和高分子量產物。這些序列可導致非特異擴增和訊號強度的降低。引物不用時應存於–20℃儲存。引物的設計原則：見引物的設計

l引物的用量：一般PCR反應中引物的終濃度為0。1~1umol/L，引物濃度過低則產物量降低；引物濃度過高會促進非特異產物合成，還會增加引物二聚體的形成，它們與靶序列競爭DNA聚合酶和dNTP，從而使靶序列的擴增量降低。

2．緩衝液

目前最為常用的緩衝體係為10~50mmol/L。Tris是一種雙極性離子緩衝液，20℃時其pKa值為8。3，△pKa值為–0。021/℃。因此，20 mmol/L Tris–HCI（pH8。3，20℃）在實際PCR中，pH變化於6。8~7。8之間。改變反應液的緩衝能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L， pH8。9，有時會增加產量。反應混合液中50mmol/L以內的KCl有利於引物的退火， 50mmol/L NaCl或50mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應液中以NH4+代K+，其濃度為16。6mmol/L。反應中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明膠（0。01%）或Tween20（0。05%~0。1%）有助於酶的穩定，反應中加入5 mmol/L的二巰蘇糖醇（DTT）也有類似作用，尤其在擴增長片段（此時延伸時間長）時，加入這些酶保護劑對PCR反應是有利的。

3。Mg2+

lMg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的，也影響著引物的退火，模板與PCR產物的解鏈溫度，產物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，則酶催化非特異的擴增。

lPCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可與Mg2+結合，降低Mg2+濃度，而Taq DNA聚合酶需要的是遊離Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP濃度高0。2~2。5m mol/L。最好對每種模板，每種引物均進行Mg2+濃度的最佳化。另外還需注意引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合劑也會影響遊離Mg2+濃度。

l最佳化Mg2+濃度法：首先須知模板DNA，引物和dNTP濃度和設定的PCR迴圈引數。反應中的PCR緩衝液中不加Mg2+。Mg2+是從10mmol/L MgCl貯存液中逐一加入反應管中。開始以0。5mmol/L遞增（0。5、1。0、1。5、2。0、2。5~5。0mmol/L），在確定了Mg2+大概濃度以後，再在該濃度上下，以0。2 m mol/L遞增和遞減幾個濃度來精確確定Mg2+的最適濃度。

4．三磷酸脫氧核苷酸

？0？2？0？2 l貯備dNTP液應用NaOH調pH至中性，其濃度用分光光度計測定。貯備液為5~10 mmol/L，分裝後–20℃儲存。在PCR的重複熱迴圈過程中其熱穩定性應為：50迴圈後約有50%仍為dNTP。

l 反應中每種dNTP（dATP，dGTP，dTTP和dCTP）的終濃度為20―200umol/L，在此範圍中，PCR產物量、特異性合成和忠實性間的平衡最佳。所用的四種dNTP終濃度應相等，以使錯誤摻入率降至最低。最低的適宜dNTP濃度可根據特定靶序列長度和鹼基組成來確定。保持四種dNTP的濃度均在10~15umol/L以上，對保持鹼基摻入的忠實性是很重要的。dNTP終濃度大於50 mmol/L時會抑制Taq DNA聚合酶活性。

ldNTP的類似物也可摻入PCR產物。

5．耐熱DNA聚合酶

l自從耐熱Taq DNA聚合酶引入PCR後，又有多種耐熱DNA聚合酶（VENT和Tth等）相繼用於PCR。目前仍以Taq DNA聚合酶應用較多。不同來源聚合酶製備條件、測定方法和（或）單位定義有所不同，使用時需加以注意。

l酶的需要量可根據不同的模板分子或引物而變化。當最佳化PCR時，最好在每100μ1反應體積中加入0。5~5U酶的範圍內試驗最佳酶濃度。如果酶濃度太高，則瓊脂糖凝膠電泳中會出現非特異擴增帶；過低時，則靶序列產量很低。

lPCR後可透過下述方式之一滅活Taq DNA聚合酶：（1）99~100℃加熱10min；（2）加入EDTA-Na至10mmol/L螯合Mg2+；（3）酚一氯仿抽提、乙醇沉澱PCR產物。

6．溫度迴圈引數

①變性溫度與時間：PCR的變性一步很重要，此步若不能使靶基因模板和（或）PCR產物完全變性，變會導致PCR失敗。典型的變性條件是95℃30s或97℃30s，更高的溫度可能更有效，尤其是對富含G+C的靶基因。DNA在其鏈分離溫度（strand separation temperature，Tss）時的變性只需幾秒鐘，然而反應管內部達到Tss還需一定時間。變性溫度太高會影響酶活性。最簡單的方法是在加Taq聚合酶前選使模板在先97℃變性lmin，對PCR的成功亦有益處。環狀質粒DNA模板最好酶切線性化，因環狀DNA復性極快。在擴增短片段（100~300bp）時，可用簡便、快速的兩步PCR法，同時在5~10個迴圈後，將變性溫度降至87~90℃可改善PCR產量。具體降低程度則根據具體反應和使用的PCR儀而定。

②復性溫度與時間：如果說變性溫度對PCR反應的成敗是關鍵，那麼復性溫度則決定著PCR的特異性。引物復性所需的溫度與時間取決於引物的鹼基組成、長度和濃度。合適的復性溫度應低於擴增引物在PCR條件下真實Tm值的5℃。根據下式計算最適復性溫度（Tm）有助於PCR的成功。

另一種更簡便的方法是透過引物的有效長度（Ln）來估算。在此，還需引入另一概念，即有效啟動溫度（effective priming temperature Tp）。Tp是最佳引物介導擴增發生時的最高溫度。Tp在一定範圍（20~35個核苷酸）內與Ln呈直線相關。Lp=22+1。45（Ln）：其中Ln=2（G+C）+（A+T）最適復性溫度為Tp±2~5℃。Tp值較引物模板的Tss值高5~10℃，這是因引物復性後，DNA聚合酶很快發生聚合反應，在引物3’端加上數個鹼基使引物–模板更穩定，易於在較高溫度下發生延伸。研究表明，引物的復性是受動力因素控制的，而不是受熱力學引數控制的。它取決於引物解離與延伸效率間的平衡。Tp僅是PCR的最適復性溫度，也是PCR最佳特異性溫度，在等位基因特異PCR（AS–PCR）時決定Tp很重要。Tp值基本上不受Mg2+濃度影響，當Mg2+由1。5mmol/L升至10 mmol/L時，Tp才升高3℃。確定了復性溫度後，復性時間並不是關鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。復性時間也不能太短（≥30s），如用手控溫度反應，復性狀態的時間不能太長，耽擱過長會增加非特異復性。

③延伸溫度與時間

引物延伸溫度一般為72℃（較復性溫度高10℃左右）。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產物的特異性，也會影響其產量。72℃時，核苷酸的摻入率為每秒35~100個核苷酸，這取決於緩衝體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質。72℃延伸1min對於長達2kb的擴增片段是足夠的。然而，延伸時間決定於靶序列的長度與濃度。3~4 kb的靶序列需3~4 min延伸，延伸時間過長會導致非特異擴增帶的出現。PCR中前幾個迴圈延伸時間應足夠長以使靶序列延伸完全，對很低濃度底物的擴增延伸時間要長些。

④迴圈數

迴圈數決定著擴增程度。在其它引數都已最佳化條件下，最適迴圈數取決於靶序列的初始濃度。過多的迴圈會增加非特異擴增產物的數量和複雜性（見平臺效應）。當然，迴圈數太少，PCR產量就會極低。在初始靶序列為3X105，1。5X104，1X103和50複製分子時，其迴圈數可分別為25~30，30~35，35~40和40~45個迴圈。

除迴圈數外，擴增效率也決定擴增程度的重要因素。實驗表明，以染色體DNA為模板時，第25~30個迴圈過程中，擴增DNA明顯增加。擴增程度（Y）、起始DNA量（A）、擴增效率（R）和迴圈數（n）間的關係為：Y=A（I+R）n效率為100%時，25個迴圈後，Y=225·A=33 554 432A，而效率R=90%，n=25時，Y=1。925=9 307 649A，擴增產物減少了72%，由此可見擴增效率對擴增程度的影響。

⑤其它因素

高溫起動（hot start）：由於Taq DNA聚合酶低溫下仍具有活性。因此在一般PCR反應的開始加熱變性DNA後再加酶的過程中，引物可與模板發生非特異復性，這些非特異復性在達到72℃前就由Taq 聚合酶在其3‘端聚合上幾個鹼基並穩定了這種非特異復性引物。因此，可出現非特異延伸和擴增。採用高溫起動法便可克服這一缺點，即使Taq聚合酶僅在反應達到較高溫度（>70℃）時才發揮作用。這可透過在高溫（>70℃）下加入某些必需因子（DNA聚合酶，模板DNA，Mg2+或引物等）來控制。這種方法不僅可增加PCR的特異性，還能增加其敏感性，並可減少引物二聚體的形成和引物的自我復性。這是因為在擴增前加熱可促進引物的特異復性與延伸，因此增加了有效引物的長度。

7．PCR促進劑：

1．二甲基亞碸（DMSO）：許多耐熱DNA聚合酶廠定推薦在PCR反應中加入10%DMSO，這可能是DMSO有變性DNA的作用。DMSO的使用對大腸桿菌DNA聚合酶I K1enow片段是有益的，但對Taq DNA聚合酶有抑制作用，一般反應中應儘量不用DMSO。不過，在複合PCR中可以用。

2．甘油：有報道，反應中加入5%~20%甘油有助於PCR反應的復性過程，尤其對G+C含量高和二級結構多的靶序列以及擴增長片段（>1。5kbp）更適用。

3．氯化四甲基銨（TMAC）：在反應中加入1X10–4~1X10–5mol/L的TMAC可促進PCR，去除非特異擴增，而不抑制Taq聚合酶。

4．T噬菌體基因32蛋白質（gp32）：加入0。5~1μl的gp32（lnmol/L， PHarmacia）可使Taq聚合酶對長片段DNA的擴增改善至少10倍。

5．石蠟油：反應中所用石蠟油質量要高，不能含抑制Taq DNA聚合酶活性的雜質。加石蠟油目的是防止反應液蒸發後引起的冷卻與反應成分的改變。石蠟油的有無對反應影響較大。但現在PE–Cetus公司又研製了一種新型PCR儀–9600型基因擴增PCR系統，免除了加石蠟油的步驟。

希望對你有用。